康平生物获得发明专利授权：一种生物活性多肽PIGSENSGKTTMPL及其制备技术
发布时间：
2021-03-02
作者：
黑龙江省康平生物工程有限责任公司
康平生物获得国家知识产权局发明专利授权，专利号为ZL201711288374.8，授权公告日为2021年3月2日。截至目前，康平生物已累计获得17项技术专利，核心技术壁垒持续巩固。
技术领域
本发明涉及蛋白领域，尤其是涉及一种生物活性多肽PIGSENSGKTTMPL及其制备方法和应用。
背景技术
在牛乳经乳酸菌发酵的过程中，牛乳中的一部分蛋白质被乳酸菌代谢利用，并发生了一系列生理生化反应，使蛋白质变为多肽或者游离的氨基酸，被人体消化吸收或通过小肠上皮细胞的吸收转运直接进入人体的血液循环。在这些多肽中，有一部分具有特殊的生理功能，被称为”生物活性肽”。
在天然食物来源中寻找安全的生物活性肽尤为重要。近些年来，人们发现一些食物来源的多肽类物质具有良好的生物活性，如玉米短肽、大豆肽、牛乳多肽等。这些多肽可以通过微生物发酵、消化酶解等多种途径得到，并且大多具有生物活性的多肽是由2～20个氨基酸残基组成，分子量小于6000Da，含有一定量的疏水氨基酸、芳香族氨基酸。
发明内容
本发明的目的在于提供一种生物活性多肽PIGSENSGKTTMPL及其制备方法和应用。本发明第一方面，提供一种生物活性多肽PIGSENSGKTTMPL，其氨基酸序列为Pro-Ile-Gly-Ser-Glu-Asn-Ser-Glu-Lys-Thr-Thr-Met-Pro-Leu，如SEQ ID NO：1所示。所述生物活性多肽为乳源性。具体来源于αs1-酪蛋白，并且为αs1-酪蛋白变体C第185～198位的氨基酸残基。αs1-酪蛋白变体C氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。αs1-酪蛋白的氨基酸序列以及对应的核苷酸序列为既有技术，编码αs1-酪蛋白变体C第185～198位氨基酸残基的核苷酸片段能编码成熟的生物活性多肽PIGSENSGKTTMPL。
本发明第二方面，提供了编码所述生物活性多肽PIGSENSGKTTMPL的核苷酸片段，其序列为：5’-cct att ggc tct gag aac agt ggc aag act act atg cca ctg-3’，如SEQ ID NO：2所示。
本发明第三方面，提供了所述生物活性多肽PIGSENSGKTTMPL的制备方法，可以通过基因工程的方法人工合成，可以从乳制品中通过分离纯化的方法直接获得，可以直接通过化学合成制备。
实施例1 活性肽PIGSENSGKTTMPL的人工合成
一、生物活性肽的合成
1.称取RINK树脂3g(取代度0.3mmol/g)于150ml的反应器中，用50ml的二氯甲烷(DCM)浸泡。
2.2小时后，用3倍树脂体积的氮-二甲基甲酰胺(DMF)洗涤树脂，然后抽干，如此重复四次，将树脂抽干后待用。
3.向反应器中加入一定量的20%哌啶(哌啶/DMF=1:4,v:v)，放在脱色摇床上摇晃20min，以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用3倍树脂体积的DMF洗涤四次，然后抽干。
4.取少量树脂用茚三酮(九井水合茚三酮)法检测(检A、检B各两滴，100℃反应1min)，树脂有颜色，说明脱保护成功。
5.称取氨基酸Pro适量和1-羟基-苯骈三唑(HOBT)适量于50ml的离心管中，加入20ml的DMF将其溶解，然后加入3ml的N,N二异丙基碳二亚胺(DIC)振荡摇匀1min，待溶液澄清后加入到反应器中，然后将反应器置于30℃的摇床中反应。
6.2小时后，用一定量的醋酸酐封头(醋酸酐:DIEA:DCM=1:1:2,v:v:v)半小时，然后用3倍树脂体积的DMF洗涤四次，抽干待用。
7.向反应器中加入一定量的20%哌啶(哌啶/DMF=1:4，v:v)，放在脱色摇床上摇晃20min，以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用DMF洗涤四次，然后抽干。
8.取少量树脂用茚三酮(九井水合茚三酮)法检测(检A、检B各两滴，100℃反应1min)，树脂有颜色，说明脱保护成功。
9.称取后面第二个氨基酸适量和HOBT适量于50ml的离心管中，加入25ml的DMF将其溶解，然后加入2.5ml的DIC振荡摇匀1min，待溶液澄清后加入到反应器中，然后将反应器置于30℃的摇床中反应。
10.1小时后，取少量树脂检测，用茚三酮法检测(检A、检B各两滴，100℃反应1min)，若树脂为无色，说明反应完全；若树脂有颜色，说明缩合不完全，继续反应。
11.待反应完全后，用DMF洗涤树脂四次，然后抽干，向反应器中加入一定量的20%哌啶(哌啶/DMF=1:4,v:v)，放在脱色摇床上摇晃20min，以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用DMF洗涤四次，然后抽干检测保护是否脱去。
12.按照步骤9-11依次接上氨基酸Ile、Gly、Ser、Glu、Asn、Ser、Gly、Lys、Thr、Thr、Met、Pro和Leu。
13.待接上最后一个氨基酸后，脱去保护，用DMF洗涤四次，然后用甲醇将树脂抽干。然后用95切割液(三氟乙酸:1,2乙二硫醇:3，异丙基硅烷:水=95:2:2:1,v:v:v)将多肽从树脂上切割下来(每克树脂加10ml切割液)，并用冰乙醚(切割液：乙醚=1:9,v:v)离心沉降四次。
至此，人工合成了生物活性肽PIGSENSGKTTMPL。
二、生物活性肽的确认
1)UPLC分析
UPLC条件如下：仪器：Waters ACQUITY UPLC超高效液相-电喷雾-四级杆-飞行时间质谱仪。色谱柱规格：BEH C18色谱柱。流速：0.4mL/min。温度：50℃。紫外检测波长：210nm。进样量：2μL。梯度条件：A液：含有0.1%甲酸(v/v)的水，B液：含有0.1%甲酸(v/v)的乙腈。
2)质谱分析
质谱条件如下：离子方式：ES+。质量范围(m/z)：100-1000。毛细管电压(Capillary)(kV)：3.0。采样锥(V)：35.0。离子源温度(℃)：115。去溶剂温度(℃)：350。去溶剂气流(L/hr)：700.0。碰撞能量(eV)：4.0。扫描时间(sec)：0.25。内扫描时间(sec)：0.02。
3)结果
根据以上分析方法，利用超高效液相-电喷雾-四级杆-飞行时间质谱，对生物活性肽PIGSENSGKTTMPL进行色谱分析和质谱分析，其质量色谱提取图如图1所示，提取此峰的二级质谱图和az、by断裂情况如图2和3所示，可得此峰的多肽质荷比为716.3632Da，保留时间是28.4min。由图3可知，根据az、by断裂的情况，经过Mascot软件分析计算，得到质荷比716.3632Da的片段序列为Pro-Ile-Gly-Ser-Glu-Asn-Ser-Glu-Lys-Thr-Thr-Met-Pro-Leu(PIGSENSGKTTMPL)，记为SEQ ID NO：1。该片段与αs1-酪蛋白变体C第185～198位的残基序列相对应，αs1-酪蛋白氨基酸序列的GenBank编号为AAA30428.1，序列见SEQ ID NO：3。
本专利为乳蛋白的深度开发利用提供了新的技术选择。
免责声明
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关键词：牛初乳冻干粉,粉剂,颗粒剂,胶囊剂,固体饮料
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